自发明以来，PCR 彻底改变了基因序列的操作。随着定量 PCR (qPCR) 的引入，能够以前所未有的精度和灵敏度测量这些基因的表达水平。
Biosearch 提供至关重要的荧光淬灭探针和引物基因表达分析的组成部分。 DNA 复制会触发探针发出的荧光，以便将扩增动力学与初始拷贝数相关联。探针还提供额外的序列特异性，以确保监测的扩增确实是感兴趣的基因。
以下是 qPCR 机制的简要概述。我们欧tline 几种不同的定量方法应用于基因表达分析，但同样适用于拷贝数测定的其他用途，例如等位基因丢失分析和病毒载量测定。
qPCR 的原理PCR 产品通常在反应完成后使用双链 DNA 结合染料（如溴化乙锭）进行分析，以显示扩增的片段。这种终点分析非常适合进一步操作产物，但在反应开始之前不提供拷贝数（数量）的指示。
在热之前将荧光标记的探针直接合并到反应管中循环允许实时监测扩增。信号被设计为保持隐藏，直到通过使用 Black Hole Quencher® 染料等暗猝灭剂进行 DNA 复制，这些猝灭剂也附着在探针上并位于荧光团对面。
反应动力学可以与初始值相关联。复制通过监视此信号的数量增加。如果一个反应放大了与另一个反应相同的目标，但从一半数量的分子开始，那么它将额外消耗一个循环来实现相同的荧光水平。该荧光阈值必须落在指数阶段内，定量关系才有效。反应跨越此阈值的循环#称为循环阈值或 CT 值。
图 1：两个 qPCR 反应扩增相同的序列，但从不同的拷贝数开始。如果已知扩增效率，则它们的相对量可以表示为 N/M = E^ΔCT。
描述指数扩增的数学方程为：N2 = N1 x E^ ΔC
其中 N2 为ΔCT 循环后目标分子的数量，从定量开始N1 的 ty 和 E 的效率。第二个反应 M 跨越与 N1 相同的阈值，但延迟 ΔCT。在此阈值下，M2的数量等于N1，可以代入上式：N2 = M2 x E^ΔCT。如果效率为 100% (E = 2) 并且在反应之间观察到 1 个循环延迟 (ΔCT = 1)，则 N2 是 M2 数量的两倍。检测验证通过 qPCR 进行基因表达分析需要一系列技术，每一个都仔细执行，以产生有效的结果。由于 mRNA 本质上不稳定，因此需要绝对小心以确保转录本在提取和后续操作过程中不会降解。基因表达的 qPCR 分析有时也称为 RT-qPCR，因为逆转录会生成用于扩增的 cDNA。据观察，逆转录在 mRNA 测量中引入了大部分变异性。
mRNA 定量中逆转录反应的特性。斯塔林(&A)g；hlberg，A.，等。等人。临床。化学。 2004a. 50(3), 509–515.
一旦 mRNA 被逆转录为 cDNA，通常会使用几种不同的方法来定量 cDNA，称为绝对定量和相对定量。无论采用哪种方法，都需要已知浓度的标准模板来代表目标并验证测定性能。该标准品可以是合成扩增子、线性化质粒，甚至是从先前反应中纯化的 PCR 产物。
图 2：目标标准品的四倍稀释系列显示 CT 值之间的 2 个周期间隔，或 100% 有效扩增。
在大范围的拷贝数中稀释此标准品，每次稀释都提供扩增的起点。因为这些量是预先知道的，所以放大器该系列的阳离子揭示了测定效率和灵敏度。未知拷贝数的样品只有在验证范围内（稀释系列范围内）才能进行定量。
扩增效率由稀释之间的 CT 值间隔表示。间隔为 3.3 个循环的 10 倍稀释系列表明效率为 100%，计算公式为：E = 10^(1/k) - 1。k 是稀释间隔，也用标准曲线的负斜率表示.
